Durante suas aventuras na Itália, Ezio terá à disposição um arsenal de instrumentos que o auxiliarão em suas missões. Diferentemente do primeiro jogo, o jogador poderá utilizar não só espadas e facas mas maças, machados e lanças, cada uma com suas vantagens(também foram acrescentados novos contra golpes que chamam muita atenção pela brutalidade e estilo de matar). Além disso, agora Ezio portará duas hidden blades que beneficiam o jogador em combate e em assassinato(é possível matar dois inimigos de uma só vez) e alguns apetrechos bem legais: uma agulha com veneno, a qual causa loucura nos guardas seguida da morte deles e uma pistola de pulso, muito boa para liquidar arqueiros ou alvos diversos.
Mas Ezio não sairá desprotegido em suas missões porque contará com armaduras especiais compradas em ferreiros(apenas a armadura de Altair é adquirida de modo diferente mas também é a única que muda a cor das roupas de Ezio, para tingir as roupas é necessários ir num alfaiate de quaisquer cidades do jogo). São elas: Leather Armor, Helmschmied Armor, Metal Armor, Missaglias Armor e Armor of Altair.
Fora estes equipamentos temos as facas arremessáveis, bombas de fumaça, remédios, o próprio dinheiro de Ezio que é usado em diversas atividades(até pra distrair guardas e pessoas) e as capas que podem ajudar o jogador a transitar nas cidades.
O jogo começa imediatamente após os eventos de Assassin's Creed. Desmond e uma aspirante a assassina, Lucy Stillman, escapam do laboratório de Abstergo, seguindo para um esconderijo dos assassinos. Desmond descobre que os assassinos, com poucos recursos e dinheiro, estão tendo dificuldades para vencer os templários. Stillman, um dos assassinos, revela que ela e uma nova equipe têm trabalhado em um novo dispositivo, o Animus 2.0. Desmond então vê as memórias de um novo assassino através da nova máquina.
O jogador assume o papel de um jovem nobre que se tornou assassino, chamado Ezio Auditore. O pai de Ezio e seus irmãos, acusados de trair a cidade de Florença, são executados em praça pública. Ezio também seria executado, porém conseguiu escapar da morte. Ezio então parte junto com sua mãe e sua irmã para a vila dos Auditore, onde descobre que seus irmãos e seu pai eram secretamente assassinos. Ezio passa a ajudar seu tio Mario na guerra entre os templários e os assassinos, com o intuito de se vingar dos causadores da morte de sua família. Como Altair no primeiro jogo, Ezio é um ascendente de Desmond Miles, o barman dos dias modernos que foi capturado em Abstergo, com o próprio Ezio sendo descendente de Altair (7 gerações separam Ezio de Altair).
O jogo se passa no século XV, na Itália, durante o Renascimento, aproximadamente trezentos anos após o primeiro jogo. Como Assassin's Creed, os personagens baseados em figuras históricas estão presentes no jogo incluindo Leonardo da Vinci, Niccolò Machiavelli, Catarina Sforza, Lorenzo de' Medici, Rodrigo Bórgia e Cesar Bórgia. Ao contrário de Altair, o qual o dedo anelar foi amputado para acomodar o uso de sua lâmina escondida, Ezio tem o seu dedo o qual ostenta um anel com o brasão de sua amada. No enredo do jogo existe uma piada interna em que Leonardo da Vinci conserta a mesma lâmina e diz para Ezio que ele deveria amputar o dedo anelar para poder usá-la, Ezio acredita em Leonardo e coloca o dedo em cima de uma mesa para o amputamento, mas Leonardo aproveita para dar um susto em Ezio e diz que com as modificações feitas por ele na lâmina não era mais necessário o usuário fazer aquilo. É possivel que a Lâmina Oculta de Ezio seja a mesma que fora usada por Altair e que talvez a família de Desmond tenha a tradição de passa-la de pai para filho.
